準備第三代定序分析所需的輸入檔案

pb-16S-nf 沿襲了 QIIME2 [Day 06] 的特色，
同樣需要下列輸入檔案，在格式上與次世代相當類似 :

1. 定序出來的原始檔案 (.fastq.gz or .fastq)
2. manifest.tsv
3. sample-metadata.tsv

以下範例程式運行會耗時半天以上，使用國網(NCHC)或自家伺服器>32 CPUs較佳，
若時間有限會建議所有定序檔案路經改為
pb-16S-nf/test_data/test_1000_reads.fastq.gz，會跑很快~

• 下載範例定序資料 (.fastq.qz)

  下載公開文獻資料的原理與安裝請見 [Day 04 ]，就不贅述。

  本次範例選擇汙水微生物菌相序列作為教學 (LaMartina, E. L., Schmoldt, A. L., & Newton, R. J., 2022) :
  
  其序列為 PacBio 16S Full Length (27F & 1492R) ，
  accession number 為 PRJNA809416 並餵給 SRA Run Selector，
  這次選擇四個檔案當示範~
  
  教學方便，我創一個資料夾TGS_sewage在pb-16S-nf下 :

  mkdir TGS_oral
  cd TGS_oral
  

  將以下序列檔案編號放入 SRR_Acc_List.txt，並放到TGS_sewage下 :

  vi SRR_Acc_List.txt
  

  貼上來自 PRJNA809416 的其中四個檔案 :

  SRR18111929
  SRR18111930
  SRR18111931
  SRR18111932
  

  製作 batch_download.py :

  vi batch_download.py
  

  from bioinfokit.analys import fastq
  fastq.sra_bd(file='SRR_Acc_List.txt', t=16, other_opts='--split-files' )
  

  啟動SRA_download虛擬環境並執行 batch_download.py，
  這裡會需要一些時間，可以去買杯咖啡~

  conda activate SRA_download
  
  python batch_download.py
  

  若出現 No module named 'bioinfokit'，回到 [Day 04] 安裝 bioinfokit。

  將定序檔案壓縮 :

  gzip *.fastq
  

  順利的樣子 :

  XXXXXX users 45418123 Oct  4 00:27 SRR18111929.fastq.gz
  XXXXXX users 37210512 Oct  4 00:19 SRR18111930.fastq.gz
  XXXXXX users 54730305 Oct  4 00:32 SRR18111931.fastq.gz
  XXXXXX users 37175973 Oct  4 00:35 SRR18111932.fastq.gz 
  

• 樣本清單檔案 manifest.tsv

  manifest 是清單的意思，與 QIIME2 輸入格式相同，
  檔名為 manifest.tsv，
  路徑XXXXXX記得更改成自己的

  sample-id       absolute-filepath
  1St_29_Kenedy_Texas     /home/XXXXXX/pb-16S-nf/TGS_sewage/SRR18111929.fastq.gz
  1St_152_Metro_North     /home/XXXXXX/pb-16S-nf/TGS_sewage/SRR18111930.fastq.gz
  1St_151_Laramie /home/XXXXXX/pb-16S-nf/TGS_sewage/SRR18111931.fastq.gz
  1St_141_Mendenhall      /home/XXXXXX/pb-16S-nf/TGS_sewage/SRR18111932.fastq.gz
  

  若時間有限會建議所有定序檔案路經改為pb-16S-nf/test_data/test_1000_reads.fastq.gz 發現了嗎 ?
  與 NGS V3-V4 雙尾定序的資料不同，每個樣本僅有一個定序檔案，
  因為突破了技術限制，不須雙邊讀取，

• 註釋資料 sample-metadata.tsv

  metadata 是後設資料、註釋資料的意思，
  可以根據實驗設計新增新的 column ，
  與次世代分析相同，新增index一個樣本一組，
  範例中也新增組別名為group分別為A, B
  檔名為 sample-metadata.tsv :

  sample_name     index       group
  1St_29_Kenedy_Texas     1St_29_Kenedy_Texas     A
  1St_152_Metro_North     1St_152_Metro_North     A
  1St_151_Laramie 1St_151_Laramie B
  1St_141_Mendenhall      1St_141_Mendenhall      B
  

環境、檔案都有了，下回跑分析 !